I. Génétique et physiopathologie de l’hypercholestérolémie familiale

L’hypercholestérolémie familiale à transmission autosomique dominante (ADH) est génétiquement hétérogène et regroupe des formes de fréquence moyenne à très rare. Les travaux de l’équipe ont permis d’identifier une nouvelle protéine impliquée dans la pathogenèse de la maladie : PCSK9, une nouvelle proprotéine convertase. L’importance de cette découverte est attestée par le volume considérable de publications internationales parues depuis notre découverte (plus de 230).

Notre projet de recherche est de poursuivre l’étude des évènements pathogéniques associés à l’ADH. Nous avons pour objectif de : 1) poursuivre la cartographie et l’identification de nouveaux gènes impliqués dans l’ADH (HCHOLA4 et HCHOLA5), et 2) poursuivre l’exploration du rôle de PCSK9 et des nouveaux gènes identifiés dans le métabolisme du cholestérol.

Notre stratégie de recherche combine des analyses génétiques (études familiales, cartographie pangénomique, évaluation moléculaire et cellulaire de gènes candidats, séquençage haut débit), études in vivo de cinétique de lipoprotéines et recherche in vitro d’un trait métabolique intermédiaire spécifique des différentes formes moléculaires d’ADH, études de modèles murins. Nous avons l’expertise et donc une autonomie complète pour les analyses génétiques. 

Objectif 1: Cartographie génétique et identification des gènes HCHOLA4 and HCHOLA5

Le premier objectif du projet est l’identification de deux nouveaux gènes d’ADH (HCHOLA4 and HCHOLA5). Dans un domaine international hautement compétitif, notre originalité et notre force reposent dans l’étude génétique de familles rares. Cette approche est difficile car elle nécessite de disposer de grandes familles particulièrement bien phénotypées. Le Réseau National de Recherche sur les Hypercholestérolémies (que nous avons mis en place il y a 10 ans) est composé de 14 centres cliniques. Il nous a permis de constituer une collection de plus de 500 familles ADH.

Dans la collection actuelle, nous avons sélectionné 40 familles dites « non-LDLR/non-APOB/non-PCSK9 ». Par cartographie génétique pangénome, nous avons localisé dans 2 grandes familles (HC6 et HC126), un premier gène HCHOLA4 en 16q22 dans une région de 5 Mb contenant plus de 100 gènes, puis un deuxième gène HCHOLA5 sur un autre chromosome dans un intervalle de 0,9 cM (940 kb) qui contient 35 gènes. Après différents essais d’identification des gènes impliqués, incluant la réduction des intervalles critiques et le séquençage de nombreux gènes candidats, nous avons décidé de procéder à un séquençage de type « whole exome ». Cette étude est en cours de réalisation chez 19 sujets appartenant à 6 familles dont HC6 (gène HCHOLA4) et HC126 (gène HCHOLA5). Une fois identifiés, le(s) gène(s) HCHOLA4 et/ou HCHOLA5 seront étudiés chez les proposants des autres familles d’intérêt. Nous pourrons alors déterminer la contribution de chacun des nouveaux gènes au phénotype ADH. Notre expérience avec l’identification du gène PCSK9 nous amène à penser qu’il est fort vraisemblable que les nouveaux gènes seront porteurs de polymorphismes fréquents ayant un effet sur la variabilité des taux de LDL (hyper- et hypocholestérolémie). Pour tester cette hypothèse, nous étudierons ces gènes dans différentes populations déjà disponibles et bien caractérisées :

- dans la plus grande collection nationale de proposants ayant une hypocholestérolémie (en collaboration avec le Dr. A. Carrié et le Pr. E. Bruckert, hôpital Pitié-Salpêtrière) nous rechercherons des mutations ayant un effet en miroir de celles associées à l’ADH (comme cela a été démontré dans les gènes APOB et PCSK9)

- dans 50 sujets porteurs de la même mutation (dite « allèle libanais », p. C681X) dans le gène LDLR, nous testerons l’hypothèse que l’un des nouveaux gènes puisse être un modificateur de l’effet hypercholestérolémiant de la mutation

- enfin, nous émettons l’hypothèse que des variants de ces gènes pourraient être associés à l’infarctus du myocarde et/ou à des variations de l’épaisseur intima-media de la carotide. Pour tester cette hypothèse, nous établirons une collaboration avec le Pr. F. Cambien pour l’étude de ses grandes cohortes. Ce type d’étude nous permettra peut-être de mettre en évidence de nouveaux facteurs de risque génétique d’athérome.

Objectif 2: Rôle de PCSK9 dans le métabolisme du cholestérol et pathogénie de l’ADH

Le deuxième objectif est de mieux définir le rôle de PCSK9 dans le métabolisme hépatique du cholestérol et de comprendre les mécanismes pathogéniques conduisant chez l’homme à une hypercholestérolémie et à ses complications cardiovasculaires. Plus précisément, nous souhaitons concentrer nos efforts sur la compréhension du rôle de PCSK9 sur le métabolisme des lipoprotéines riches en apo B-100 en travaillant sur des modèles murins. Pour réaliser cet objectif, nous avons choisi de développer deux modèles transgéniques : une souris transgénique classique avec une surexpression hépatique restreinte du transgène humain (modèle dose/réponse) et une souris KI sans restriction d’expression pour l’étude de l’effet de la mutation tant sur le métabolisme lipoprotéique que sur d’autres organes/tissus où le gène PCSK9 est exprimé.

Dans ce domaine, il existe aussi une très forte compétition internationale. Nous pensons néanmoins pouvoir maintenir un avantage compétitif car nous avons choisi une mutation que nous avons identifiée chez un proposant français, la mutation p.R357H (Allard et al., 2005). Cette mutation a été choisie car elle touche un résidu hautement conservé du domaine catalytique. Nous n’avons publié cette mutation que tardivement, après que nos compétiteurs aient démarré leurs propres projets transgéniques sur les premières mutations que nous avions décrites. Nos modèles sont donc uniques. De plus, nous avons intentionnellement cherché à obtenir des modèles présentant soit un profil d’expression restreint au foie, soit un profil normal. Ce 2ème modèle doit permettre la découverte d’éventuelles altérations ne touchant pas seulement le métabolisme des lipoprotéines, révélant ainsi un autre pan du rôle physiologique de PCSK9 (pan encore totalement inconnu mais dont l’existence est supposée du fait des profils d’expression tissulaire). Du fait des différences métaboliques entre la souris et l’homme, il est prévu d’humaniser les modèles murins par croisement avec des souris transgéniques porteuses de l’apo B-100 humaine. Pour réaliser ces études, nous avons établi une collaboration étroite avec A. Kalopissis (UMR 872, Centre de Recherche des Cordeliers, Paris) et pourrons aussi largement bénéficier des compétences de l’unité d’accueil.

II. Variabilité génétique du syndrome de Marfan et des anévrysmes de l’aorte ascendante

Le syndrome de Marfan (SM), est le prototype des maladies du tissu conjonctif. Le syndrome touche 1 sujet /5 000 et se transmet sur le mode autosomique dominant. Au plan clinique, le syndrome associe des atteintes squelettiques, oculaires, aortiques, pulmonaires, cutanées, ligamentaires dont le degré d’atteinte est hautement variable selon les malades. La morbidité et la mortalité du syndrome sont dues aux complications de l’atteinte de l’aorte ascendante (anévrysmes et dissections). La majorité des formes sont associées à une mutation dans le gène FBN1 codant la fibrilline-1, constituant majeur du réseau microfibrillaire. Plus de 1500 mutations ont été rapportées à ce jour dans ce gène et sont regroupées dans une base de données internationale développée dans le groupe et mise à jour en collaboration avec G. Collod-Béroud (Inserm U827, Montpellier). La fibrilline possède un double rôle dans la matrice : structure d’élasticité modérée au niveau des ligaments et des fibres élastiques ; récepteur du TGF b. Des mutations dans le gène FBN1 sont aussi retrouvées dans un groupe hétérogène de maladies héréditaires (« les fibrillinopathies ») où l’on retrouve toutes les atteintes du spectre clinique du SM diversement associée ou présentent de façon isolées [atteintes squelettiques, ou ectopie du cristallin isolée ou anévrysme de l’aorte ascendante (TAA)].

Les travaux du groupe ont permis de montrer l’existence d’une hétérogénéité génétique du SM et la mise en évidence de l’implication d’un deuxième gène. Ce gène a été localisé en 3p24.2-p25 puis identifié comme étant le gène TGFBR2 codant le récepteur de type 2 du TGF b. Comme pour les formes liées aux mutations du gène FBN1, il existe une grande variabilité d’expression et des maladies alléliques à ce locus : le syndrome de Loeys-Dietz et des formes isolées d’anévrysme. Ces travaux montrent aussi qu’il existe une grande hétérogénéité génétique des formes familiales de TAA.

Notre projet de recherche a pour objectif d’identifier des facteurs génétiques (primaires et secondaires) associés à la variabilité phénotypique associée tant au SM qu’aux formes familiales de TAA. Notre but est ainsi d’identifier tant des facteurs prédictifs de gravité d’évolution, que des cibles possibles de nouveaux traitements. Nous avons pour objectif de : 1) identifier de nouveaux gènes impliqués dans les TAA et 2) identifier les facteurs génétiques modulant l’évolution de l’atteinte aortique du SM.

Objectif 1: Cartographie génétique et identification de nouveaux gènes de TAA

Les anévrysmes et dissections de l’aorte thoracique ascendante partageent les mêmes étiologies chez l’homme : formes monogéniques survenant chez le sujet jeune, formes associées aux valves aortiques bicuspides, formes dégénératives observées chez le sujet âgé.  Ils peuvent survenir soit de façon isolée (TAA) soit dans un contexte syndromique [SM, syndromes d’Ehlers-Danlos (EDS), de Loeys-Dietz (LDS)]. 20 % des proposants présentant une TAA non syndromique ont un apparenté du premier degré atteint. De plus, il existe de rares et authentiques formes familiales, le plus souvent à transmission autosomique dominante. Nos travaux et ceux d’autres équipes ont aussi permis d’identifier chez des proposants TAA des mutations dans ce gène ainsi que dans le gène codant le récepteur de type 1 (gène TGFBR1 dont les mutations sont aussi responsables du LDS) et dans le gène de la fibrilline-1 (FBN1, gène majeur du MFS). Plus récemment, des mutations dans le gène ACTA2 (codant l’a actine 2) ont aussi été rapportées chez des TAA. Enfin, les groupes de X. Jeunemaitre et J-B. Michel ont révélé l’existence de mutations dans le gène MYH11 et associant TAA et persistance du canal artériel. Toutefois toutes ces mutations ne rendent compte que de moins de 20 % des TAA. Par ailleurs, l’hétérogénéité génétique est encore plus grande puisqu’il existe 2 gènes encore inconnus (AAT1 en 11q23.3-q4 et AAT2 5q13-q14).

A travers différents contrats de recherche (Inserm, Société Française de Cardiologie et ANR), 104 proposants TAA ont été inclus par le CNR Marfan (G. Jondeau), soumis à un examen clinique diagnostique complet et prélevés. Une enquête génétique a été réalisée pour tous et a permis de sélectionner plusieurs familles suffisamment grandes pour effectuer des analyses de liaison génétique. Parmi ces familles, 3 familles multiplex (dont l’une présente 15 sujets TAA) ont été particulièrement étudiées. Par analyse gène candidat et analyse de liaison l’implication d’un des gènes/locus connus a été exclue dans ces familles. Ces familles ont donc permis de révéler l’existence d’au moins un nouveau gène de TAA (AAT7 voire AAT8) dont la localisation génomique et l’identité restent à déterminer. Notre objectif est d’identifier ce (ou ces) nouveaux gènes par des approches génétiques classiques de cartographie pangénomique suivie de cartographie haute résolution régionale. L’identification du (des) gènes sera vraisemblablement réalisée par séquençage haut débit soit régionale soit « whole exome » (comme décrit dans les paragraphes au-dessus).

Au plan international, notre équipe associée au CNR Marfan et à l’unité 698 est un des leaders dans le domaine. Notre avantage concurrentiel est représenté par la taille de la collection dont nous disposons, la qualité de l’analyse clinique des patients, la disponibilité de prélèvements aortiques permettant d’avoir accès au tissu cible. A notre connaissance, seule l’équipe de D. Millewicz (Houston, Texas) dispose d’une grande collection de familles. Par ailleurs, les travaux des groupes américains sont coordonnés au sein d’une structure labellisée par le NIH (GENTAC) à laquelle C. Boileau et G. Jondeau sont associés.

Objectif 2: Identification de facteurs génétiques modulateurs de l’atteinte aortique du SM

De nombreux mécanismes modulant la pénétrance et l’expression clinique des pathologies monogéniques ont été rapportés. En pathologie humaine le paradigme du gène majeur dont les effets sont modulés par des gènes à effets mineurs au sein d’un réseau d’interactions épistatiques complexes a souvent été suggéré mais rarement démontré. Le premier effet modulateur envisagé dans les maladies à transmission dominante est celui exercé par l’allèle sain en trans de l’allèle muté. Ainsi, dans le syndrome de Marfan dû à des mutations dominantes du gène FBN1 par haploinsuffisance (mutations introduisant un codon Stop prématuré) la modulation du niveau d’expression de l’allèle sain pourrait faire varier la quantité finale de protéine fibrilline 1 sauvage et donc la sévérité de la pathologie. Nous objectif actuel est d’étudier le rôle du niveau d’expression de l’allèle sain et de l’allèle délétère dans la variabilité du diamètre aortique au niveau des sinus de Valsalva. L’étude est réalisée sur des cultures primaires de fibroblastes cutanés de témoins (Biobanque BERGAMOT, Lyon) et provenant de patients SM suivis au CNR Marfan de Bichat et porteurs d’une mutation résultant en une haploinsuffisance. Une fois cette première étude réalisée, nous procéderons à des études comparables pour tester l’effet d’autres gènes candidats. Les candidats seront choisis selon les données tant de la littérature que celles issues des travaux de J-B. Michel sur les mécanismes physiopathologiques des anévrysmes.

Dans la littérature, il n’existe encore que peu d’études de ce type. Dans le cas du SM et des mutations de la fibrilline, il n’existe que deux études préalables et contradictoires portant sur un petit nombre de sujets. L’intérêt de notre travail est d’explorer un grand nombre de malades (80) parfaitement caractérisés au plan cardiovasculaire, de travailler sur leur fibroblastes et de disposer pour certains des prélèvements aortiques (banque de tissus de l’unité 698).